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详解细胞因子试剂盒的五种检测方法

2019-07-18 浏览次数:11

  细胞因子试剂盒主要用于科研方面,不用于临床诊断,可以用于检测各种指标。做快速检测时,待检测的样品数越多,出现加错的概率也就越大,特别容易出错的是在酶联偶合物(conjugate)与样品液或标液混合的阶段,因为这时使用的是单道枪。其实解决的方法比较简单,我们只要把操作上的顺序加以调换,即先把待测液或标液加入稀释孔中,再加入酶联偶合物就不会出现错误了。而且这两个顺序交还对结果也没有影响,因为这一步的主要目的是让两种液体充分混合。
  接下来就来介绍下细胞因子试剂盒的五个检测方法:
  一、间接法:使用了二抗增加信号强度,也使抗体的选择多样化,然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体,主要用于疾病的诊断,其优点是只需要改变包被抗原,酶标抗体是通用的。
  二、捕获法:全称捕获包被法也称为反向间接法,主要用于测定血清中某类抗体亚型如IgM。为排除血清中IgG的干扰,用抗IgM抗体包被后用于捕捉样本中的IgM,然后加入特异性结合抗原进行后续检测。捕获包被法常用于对病毒性感染的早期诊断。在测定IgM的实验中常受到类风湿因子(RF,一种能结合多种动物IgG Fc的自身IgM抗体)的干扰,导致假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段制备酶标抗体可以消除RF的干扰,这一方法在双抗体夹心法中也具有同样的效用。
  三、竞争法:是用样本中的游离抗体/抗原与固相的酶标抗体/抗原竞争性结合的分析方法。当游离抗体(或抗原)浓度越高,则能与固定抗原(或抗体)结合的酶标抗体(或抗原)就越少,后续显色就越浅,即与对照相比,显色越浅,表示检测样本中抗体(或抗原)含量越高。该法特别适合小分子物质的检测也可用于检测比较不纯的样本,且重复性好,但是检测的灵敏度和专一性较差。竞争法测抗原常用于检测小分子抗原及半抗原,这类抗原通常缺乏两个以上的识别位点,不适用于双抗夹心法进行测定。该方法在商业化ELISA试剂盒中被广泛运用。竞争法测抗体常常用于检测某些干扰物质不易去除的样本及难以纯化得到抗原等情况。下图以固相酶标抗原为例,固相酶标抗体类似。其实竞争法在实际运用中有很多的花样和变种,以后我们再一一细说。
  四、直接法:仅需要抗原和酶标一抗,操作简便,可避免交叉反应,然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求,同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见,它并不能对样本中抗体进行定量分析,因为样本中抗体是非酶标抗体,无法进行后续显色,但是该法经过改进就是竞争法。
  五、夹心法:分为双抗体夹心法和双抗原夹心法,双抗体夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势,但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测,主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等疾病相关的,以及在科研中检测细胞因子等。由于双抗体夹心法特异性高,在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应,称为双抗体夹心一步法,因为操作时间短,在商业化生产中有很大优势。但双抗体夹心一步法要特别注意ELISA中的钩状效应(hook ffect),因为此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而无法形成“夹心复合物”,此时测出的结果将低于实际含量甚至是阴性结果。因此,如果使用双抗体夹心一步法测定样本中抗原含量时要注意测量的线性范围,另外使用高亲和力的单抗也可削弱钩状效应。双抗原夹心法中抗原被包被于固相,检测样本中的抗体结合于抗原后,使用酶标的抗原进行结合及后续反应,可以用来测定样本中的抗体。双抗原夹心法的关键在于酶标抗原的制备,需要根据抗原结构进行设计,在医学检验上测定抗HBsAg抗体采用的就是此法,检测时被测样本不需要稀释即可直接进行测定,故此灵敏度相对而言高于我们随后要说的间接法。

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