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ELISA实验标本如何处理和收集?

2018-09-04 浏览次数:538

能够应用ELISA 实验的样本种类很多,有血清,血浆,细胞裂解液,细胞培养上清,尿液,肺泡灌洗液,脑脊液,各种组织匀浆等,每种样本采集和处理的方式都不相同。市场部通过文献、试剂盒说明书和网友的经验,整理出以下方法仅供参考。

 

一 血清

1 采血后室温静置20min或更长时间至血清析出。

2 将采集的血液用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的 ELISA测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染,因为菌体中可能含有含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。如在冰箱中保存过久,在间接法ELISA中可使本底加深。

 

二 血浆

1 取血后加入抗凝剂(EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠等),混合10-20分钟后,30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染(也可以直接用抗凝管采集)。

2 将采集血液用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

注意事项:制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求,建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。

 

三 尿液

1 采集尿液样本500ul,加入无菌试管中。

2 用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的样本小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

 

四 细胞培养上清

1 用无菌试管收集细胞培养上清液。

2 用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

 

保存时间

一般ELISA检测样本在2-8℃下,可放置保存24-48小时;-20℃下,可放置保存1个月;-70℃下,可放置保存6个月。

 

五  组织匀浆

1 采集组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。

2 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天热时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织的小烧杯放入冰水中)。

3 匀浆的方式有多种:

a) 手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(68分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

b) 机器匀浆:用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10/次,间隙30秒,连续35次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

c) 超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5/次,间隙10秒反复35次。

4 将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000rpm离心15min,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

5 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

 

六  细胞裂解液

1 取细胞培养板或细胞悬液,用PBSPH7.2-7.4)洗涤细胞培养板1-2次。

2 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂(裂解液),使细胞破坏并放出细胞内成份。

3 用离心机4℃,2000rpm离心20min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

 

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